Szövettani vizsgálatok metodikája

Bizonyos elváltozások gyanúja esetén pl. köszvényes csomó esetében vizes fixálás nem alkalmazható, mivel az uráth kristályok kioldódnak, ilyen esetben 90 %-os alkoholban fixálandó az anyag. Speciális vizsgálatokhoz más fixáló anyagokat is használhatunk, ilyen pl. az elektronmikroszkopos vizsgálatokhoz használt Karnoy fixáló, mely chlorophormot tartalmaz, herebiopsziákhoz alkalmazott Bouin fixáló anyag.

A fixálás során természetesen a fixáló anyagnak be kell hatolni a szövetek mélyebb részeibe is, ennek sebessége kb. formalin esetében 1 mm/óra. Meggyorsíthatjuk a fixálás sebességét melegítéssel, illetve microhullámú berendezéssel való kezeléssel. Erre speciális microhullámú berendezések állnak rendelkezésre. A megfelelő idejű fixálás után kerülnek a szövettani preparatumok az un. kivágásra, mely során az elváltozás reprezentatív területeiről vágunk ki a későbbi metszetekhez megfelelő nagyságú szövetblokkokat, melyek vastagsága általában 3-4 mm, átmérője 2-4 cm. A kivágott szövetblokkok utófixálásra kerülnek, mely után kezdődik meg a tulajdonképpeni histopathológiai feldolgozás. A fixálás után általában az anyag víztelenítése következik, melyet szerves oldószerekben, általában felszálló alkoholsorban végzünk. A víztelenítés során általában paraffinba ágyazzuk anyagunkat, mely során komoly hőhatással is számolnunk kell, általában a paraffin 55-65 fok olvadáspontú. A paraffinba ágyazott anyagokat nevezzük paraffinos blokknak, melyből készülnek a mikroszkopos metszetek, a microton segítségével. A lemetszett 4-5 micron vastagságú paraffinos metszeteket a tárgylemezekre fektetve deparaffináljuk, ugyanis a festékek legtöbbször vizes bázisúak, így csak a paraffintól mentes  metszetbe képes behatolni a festőanyagok döntő többsége. A deparaffinálás felszálló alkoholsorral történik, más eljárás követendő mésztartalmú preparatumok esetében, itt előzetes decalcinálás, mész- vagy csonttartalmú anyagok esetében itt előzetes decalcinálás szükséges.

A patológiában leggyakrabban alkalmazott festés a haematoxilin eosin festés, ahol a sejtmagokat a haematoxilin, a cytoplasmát az eosin festi. Ezen festett metszetek hosszú évek után is vizsgálhatóak. A leggyakrabban használt festés még a Giemsa festés, illetve cytologiai preparatumoknál a Papanicolaou festés.

A patológiai gyakorlatban különböző szöveti alkotó elemek, vagy kórokozók megjelenítésére un. specialis festéseket alkalmazunk, melyek közül leggyakrabban használtak a következőek: PAS reactioval  /periodsav shiff/  a vicinális glycol csoportok festődnek, mely alapján a glycogen festődése érhető el, és a neutralis mucopolysaccharidok azaz nyákok, a basalmembran, illetve gombák és paraziták egy része kimutatható.

Fontos festési eljárások az un. zsírfestések, melyek általában fagyasztott metszeten végezhetőek, leggyakrabban használt ilyen festés az oil reed és a Sudan festés. Microorganizmusok detectálására használt festési eljárások közül szövettani metszeteken is végezhető a Gram festés, a Ziel-Neelsen festés,  a Koch bacterium kimutatására, a Grockott festés gombák azonosítására, és ide tartozhat a PAS reactio gombák, amoebák és a trichomonas azonosítására.

A nyáktermelés kimutatására leggyakrabban használt festés: ezüstözési eljárások /argentaphyn és argirophil festések/,  két leggyakrabban használt  festési eljárás a „Fontana-Masson” festés, illetve a Grimelius festés, ez utóbbi az apud rendszer daganatainak eredetének igazolására szolgáló festési eljárás. Amyloid festés, Kongó vörös festés alkalmazható, mely festés után polarisalt fényben az amylorid  almazöld kettőstörést mutat. Reticulin festések: a leggyakrabban használt eljárás a Gömöri festés, mely magyar pathológus után kapta nevét, használható az elasticus rostok és basalmembranok feltüntetésére. Haemosiderin kimutatására alkalmazható eljárás a Berlini-kék reactio, melanin kimutatására a Fontana-Masson festés, Kalcium jelenlétének igazolására a Kossa reactio használatos. Mucin festések között az Alcián-kék és a PAS reactio a leggyakrabban használt, Giemsa festés alkalmazható a nyirokszövet vizsgálata során microorganizmusok detectálása érdekében. Fentieken kívűl igen nagy számú specialis festési eljárás ismert és használt, melyeket ezen fejezetben nem részletezünk. Korábban elterjedten használatosak voltak az un. enzim histochaemiai vizsgálatok, melyeket azonban napjainkban az immunhistochaemiai vizsgálatok, ill. molekuláris pathológiai módszerek legnagyobbrészt kiszorítottak, ezek közül említést érdemel a ma is használatos acethyl cholinesterase reactio, mely a Hirschprung betegség diagnosztikájában használatos, a különböző vázizomzathoz kötött enzimek vizsgálata, melyek elengedhetetlenek a myopathiák differential-diagnosztikájában, valamint a haematopathologiában használatos peroxydase és choloacethyl-esterase reactiok, melyek az egyes sejtféleségek elkülönítésére szolgál.

Szükség esetén végezhető szöveti preparatumokon DOPA reactio, mely a melanocyter sejtek eredetét igazolhatja. Az enzim vizsgálatok paraffinba ágyazott metszeteken az enzim activitás elvesztése miatt nem végezhetőek.

A 80-as évek végén terjedt el világszerte az immunologiai alapokon nyugvó un. immunhistochaemiai vizsgálatok végzése is, melynek technikájára nem térünk ki, de néhány patológiában leggyakrabban alkalmazott un. antitest szerepét ismertetjük a rutin diagnosztikában.

Actin: Két fő csoportja használatos, az un. simaizom specificus és a sarcomeric actin, mely előbbi a simaizom sejtekben, az utóbbi a harántcsíkolt izomzatban, ill. ezen szövetekből eredő tumorokban mutatható ki.

Alfa foetoprotein: Onkophoetalis antigen, mely  a csírasejt eredetű tumorokban, illetve májtumorokban lehet positív.

CEA: /carcinoembryonalis antigen/: Foetalis sejtek tartalmazzák, tumor pathológiában használatos a gastrointestinalis eredetű daganatok elkülönítésére egyéb eredetű malignomáktól. Positív lehet egyéb daganatokban, tüdő, ill. a pajzsmirigy medullaris carcinomájában is.

Chromogranin: Neuroendocrin eredetű sejtekben, ill. a tumorokban a neurosecretoricus granulumokkal reagál.

Cytokeratinok: Az intermedier philamentumok csoportjába tartozó proteinek, melyek főképp hámsejtekben, ill. hámeredetű daganatokban fordulnak elő, de mesenchymalis elváltozásokban is positív lehet, legfőbb szerepük a hámtumorok elkülönítése egyéb eredetű daganatoktól. Különböző mol súlyú variansai differential-diagnosztikai lehetőséget adnak hámeredetű daganatok metastasisánál a kiindulási hely beazonosítására.

Desmin: Általános izom marker.

Epithelialis membran antigen: Epithelialis eredetű daganatokban positív, de néhány mesenchymalis tumorban, ill. egyes lymphomákban is megjelenhet.

Bilaris, fibrillaris savanyú protein: Elsősorban a neuropathológiában használatos antitest, mely az astrocytákban és ependyma sejtekben fordul elő. Megfigyelhető még a peripherias idegtumorokban és a pleiomorph adenomában.

HMB 45: Az egyik legspecificusabb melanoma marker.

Hormon receptor ellenes antitestek: Szinte valamennyi hormon ellen termeltethető antitest, mely az endocrin tumorok azonosítását segíti elő.

HCG: Csírasejtes tumorok HCG termelésének kimutatására használatos antitest.

Lymphoid markerek: Igen széles sprectruma az antitesteknek, melyek a különböző eredetű és érettségi fokú lymphoid sejtek elkülönítésére használható, ezen antitestekkel végzett vizsgálatok elengedhetetlenek a modern lymphoma diagnosztikához. Legtöbbet használt ilyen antitest a CD 20, mely a B sejtekben positív általában, CD 4, CD 8, mely a T sejtekben positív, CD 68 a histiocytákra reagál főképp, CD 30 /Ki 1/ antitest a Hodgkin kór diagnosztikájában elengedhetetlen, de jelen fejezetben valamennyi antitestet mégcsak említeni sem lehetne, számuk jelenleg jóval több mint száz.

Myoglobin: A rhabdomyosarcomák és egyéb harántcsíkolt izomeredetű elváltozások differential-diagnosztikájában használatos antitest.

Neurophilamentum ellenes antitest a neurogen daganatok diagnosztikájában játszik szerepet, positív neuroblastomában, medulloblastomában, retinoblastomákban, ill. pancreas endocrin tumoraiban, stb.

Neuronspecificus enolase: Idegeredetű sejtek által termelt enzim ellenes antitest, legtöbb ectodermalis és neuroendocrin tumorban positív.

P53 ellenes antitest a legtöbb tumorban felszaporodó mutans P53 protein ellen termeltetett antitest, melynek prognosztikai jelentősége kérdéses.

Prostata specificus antigen és prostata specificus savanyú phosphatase: Gyakran használt antitestek a prostata eredetű daganatok metastasisainak vizsgálatában.

S 100 protein: Glia vagy Schwann sejtek tartalmazzák, ezen kívül melanocyták, porcsejtek, zsírsejtek, myoepithelialis sejtek, ill. ezek tumorai.

Synaptophysin: Transmembran glycoprotein, mely a normál reactív és daganatos neuroectodermalis és neuroendocrin sejtekben, ill. tumorsejtekben positív.

Thyreoglobulin: A pajzsmirigy eredetű daganatok histogenesisének igazolására használható antitest.

Vimentin: A legáltalánosabban használt mesenchymalis marker.

A fenti immunhistochaemiai antitestek általában nem egyesével használatosak, hanem un. immun panel áll rendelkezésre, melynek segítségével a tumorok pontos histogenesisét lehet behatárolni, úgysmint hámeredetű, mesenchymalis eredetű, lymphoid vagy pld.ideg eredetű.